1965年1月3日，刘少奇在三届人大上当选国家主席，这是他的连任。
就在当天晚上召开的中央政治局常委扩大会议上，毛泽东再次不点名地批评了刘少奇。
毛泽东说：
集中了一万五千人，搞一个小县，28万人口，搞了几个月还搞不开，（工作队）学习文件四十几天，不进村，我看是搞了繁琐哲学。……你一万五千人，扎根串联。什么扎根串联，冷冷清清！……一千多户就去了五百人的工作队，怎么搞得开？搞人海战术不行。……这样集中力量打歼灭战，我看歼灭不了敌人。我看方法要改。……没有虱子不要硬找。没有虱子能找出虱子来？
毛泽东说：第二个十条“太长了，太繁了”。“四清”运动，“一是不要读文件，二是不要人多，三是不要扎根串联”，要依靠群众，清少数人，“有则清清，无则不清。”
在谈到工作队集中时间学习文件时，刘少奇解释说：工作队集中学习文件是为了反右倾。
毛泽东严厉批评：“越学越蠢！反人家的右倾，结果自己右倾。”
1月5日，毛泽东再次对刘少奇提出的主要矛盾的观点作了批评：从七届二中全会以来，一直是讲国内主要矛盾是资产阶级同无产阶级、资本主义同社会主义的矛盾，从杭州会议以来整个运动是搞社会主义教育，“怎么来了个四清与四不清的矛盾，敌我矛盾与人民内部矛盾的交叉？哪有那么多交叉？什么内外交叉？这是一种形式，性质是反社会主义嘛！重点是整党内走资本主义道路的当权派”。
这样，不仅仅对《十七条》停止执行，而且还要修改，就成为必然。
根据毛泽东的意见，在《十七条》的基础上，作了重大修改，增加到二十三条，增加了“形势”、“搞好运动的标准”、“集中力量，打歼灭战”、“抓面的工作”、“建立贫农下中农协会”、“思想方法”七条，去掉了“集团问题”一条。共形成了二十三条。
毛泽东对此文件作了修改，其中，对运动的性质问题再次在文件中加写了一段文字，严厉批评刘少奇的“四清与四不清的矛盾”和“党内外矛盾的交叉，或者是敌我矛盾和人民内部矛盾的交叉”的观点：这两种提法，“没有说明社会主义教育运动的根本性质”，“不说是什么社会里的四清四不清矛盾，也不说是什么党的内外矛盾交叉。从字面上看来，所谓四清四不清，过去历史上什么社会里也能用；所谓党内外矛盾交叉，什么党派也能用；都没有说明今天矛盾的性质，因此不是马克思列宁主义的。”
毛泽东同刘少奇的分歧，非常明显，这也引起了大多数中央领导人的注意，对这种党内高层领导人中出现的分歧忧心忡忡。
会议期间，朱德、贺龙等人曾经找刘少奇，希望他顾全大局，要谨慎，要尊重毛泽东。
刘少奇接受了这些意见，会后主动找毛泽东谈话，作了自我批评。其后，又在自己家里连续举行有部分中央领导人参加的党内生活会，听取对自己的批评和帮助，作了记录，并委托陈伯达把每天生活会的情况向毛泽东作了汇报。
毛泽东似乎对刘少奇有所原谅。
在不久后举行的一次小型会议上，毛泽东当着许多中央领导人的面说：我批评少奇同志了，但你们今后还是要听他的话哟。
众人心中提起的千斤巨石落了地。
毛泽东和刘少奇之间的分歧好像已经圆满地解决了。
但是，毛泽东接着就点燃了打倒刘少奇的导火索。
1月14日，中共中央政治局常委扩大会议讨论通过了全国工作会议纪要：《农村社会主义教育运动中目前提出的一些问题》，即《二十三条》。同一天，中共中央正式发出通知，将《二十三条》下发全党。
《二十三条》除批评了在运动性质问题上同毛泽东不一致的观点（即刘少奇的观点）外，同时也纠正了1964年下半年以来四清运动中的部分“左”的偏向，如“神秘化”、“大轰大嗡”、“繁琐哲学”等，规定“不许用任何借口，去反对社员群众”。对形势的估计，仍然是“我国城市和农村都存在着严重的、尖锐的阶级斗争”，“反对社会主义的阶级敌人，企图用‘和平演变’的方式，恢复资本主义。这种阶级斗争势必反映到党内。”文件规定：“这次运动的重点，是整党内那些走资本主义道路的当权派，进一步地巩固和发展城乡社会主义的阵地”，提出“走资派”有的在幕前，也有幕后的；支持“当权派”的人，有的在下面，也有上面的，甚至有的在省和中央部门工作。
《二十三条》的下发，尽管纠正了一些“四清”运动中的“左”的错误，但没有在根本上解决问题。到1966年3月，全国有1／3的县、社先后开展了这一运动。但随之被“文化大革命”的更大的浪潮所掩盖、所中断。
实际上，这就是“文化大革命”的第一个信号。
如果同刘少奇个人的命运联系起来，毛泽东此时对刘少奇已经不信任了。后来，毛泽东多次谈到在《二十三条》问题上同刘少奇的分歧，也认为那是他“打倒”刘少奇的起点。
1966年8月5日，毛泽东发表了《炮打司令部》的大字报，就联系了“1964年的形‘左’实右的错误倾向”，把它作为刘少奇的一大罪状。
10月25日，毛泽东在中央工作会议上说：常委分一线、二线，是我建议的；再嘛，又过于信任别人，引起我警惕，还是《二十三条》的那时候。
1970年12月18日，毛泽东会见了斯诺。
斯诺：我有一个问题想提出来，即你什么时候明显地感觉到必须把刘少奇这个人从政治上搞掉？
毛泽东：那就早■，1965年1月，二十三条发表。二十三条中间第一条就是说四清的目标是整党内走资本主义道路的当权派，当场刘少奇就反对。在那以前，他出的书黑《修养》不触及帝国主义、封建主义、国民党。
斯诺：是新版吗？
毛泽东：老版。说不要夺取政权，共产党不要夺取政权的。当个共产党不夺取政权干啥啊？！
斯诺：那么，你是不是在那时感到必须进行一场革命的？
毛泽东：嗯。1965年10月就批判《海瑞罢官》。1966年5月16日中央政治局扩大会议就决定搞文化大革命，1966年8月召开了十一中全会，十六条搞出来了。
斯诺：刘少奇是不是也反对十六条？
毛泽东：他模模糊糊。因为那时候我已经出了那张大字报了，他就不得了了。他实际上是坚决反对。
斯诺：就是《炮打司令部》那张大字报吗？
毛泽东：就是那张。
1965年1月3日，刘少奇在三届人大上继续当选为中华人民共和国主席，并担任了国防委员会主席。
从当时的纪录片上看出，刘少奇的表情很严肃，眼神中流露出忧郁的神情。因为，在同时召开的中共中央全国工作会议上，讨论社会主义教育运动的性质及当前主要矛盾时，讨论“走资本主义道路当权派”的提法时，他与毛泽东发生了分歧，并受到了毛泽东的严厉批评。
他更没有想到，接踵而来的，是更大的打击。
“文化大革命”的狂潮风起云涌（1）
“文化大革命”的狂潮风起云涌，刘少奇无奈、惶惑、愤怒，怆然曰：“好在历史是由人民写的！”
1964年7月，根据毛泽东的提议，中共中央专门成立了一个领导思想文化工作的机构——中央文化革命五人小组，组长彭真，成员有陆定一、康生、周扬、吴冷西。但是，随着“左”倾思想在党内逐步占据统治地位，一大批学术、文艺方面的著作和观点被强加了修正主义等大帽子，遭到公开批判。
1965年11月10日，上海《文汇报》突然发表《评新编历史剧〈海瑞罢官〉》，点名批判北京市副市长、历史学家吴晗，说《海瑞罢官》是为右倾机会主义翻案，“是一株毒草”。
一石击起千层浪。
文革五人小组在这种情况下，于1966年2月制定了《文化革命五人小组关于当前学术讨论的汇报提纲》，后来被称为《二月提纲》。《二月提纲》提出：“要坚持实事求是，在真理面前人人平等的原则，要以理服人，不要像学阀一样武断和以势压人”，本意是约束文化领域的大批判，不让它进一步发展为政治斗争。
3月，按预定计划，刘少奇要出访亚洲三国：巴基斯坦、阿富汗、缅甸。本来出访前，刘少奇提出不带夫人，但外事部门却坚持夫人随访会增加友好气氛，他只好同意。于是，正在乡下搞“四清”的王光美急匆匆赶回北京，准备出访。
这次访问是刘少奇最后一次出访。等他回到国内，形势已经发生了很大的变化，以至于刘少奇说：我最近这个时期对于文化革命的材料看得很少，生了一次病，出了一次国，很多材料没有看，接不上头。
刘少奇访问刚刚回国，被通知马上到杭州开会。
原来，在他出访的这一段时间里，国内形势发生了极大的变化：
——3月底，毛泽东尖锐批评《二月提纲》混淆阶级界限，不分是非，是错误的；中宣部是阎王殿，“要打倒阎王，解放小鬼”，“如果中央出修正主义，地方要造反”，“要支持小将，保护孙悟空。再不支持，就解散五人小组、中央宣传部、北京市委，不管哪个省市委！”
——4月10日，林彪、江青主持的《部队文艺座谈会纪要》经毛泽东审阅修改后作为中央文件发给全党。《纪要》宣称建国以来文艺界“被一条与毛泽东思想相对立的黑线专了我们的政”，要“坚决进行一场文化战线上的社会主义大革命，彻底搞掉这条黑线”。
——4月9日、10日，中央书记处会议批判彭真的“一系列罪行”，成立“文化革命文件起草小组”，以陈伯达、康生、江青、张春桥等为成员，起草《中国共产党中央委员会通知》，即《五一六通知》，批判《二月提纲》。
——毛泽东在修改《五一六通知》时，加写了几段火药味异常浓厚的话：
中央和中央各机关，各省、市、自治区，都有这样一批资产阶级代表人物。
必须同时批判混进党里、政府里、军队里和文化领域的各界里的资产阶级代表人物，清洗这些人，有些则要动他们的职务。尤其不能信用这些人去做领导文化革命的工作，而过去和现在确有很多人是在做这种工作，这是异常危险的。
混进党里、政府里、军队里和各种文化界的资产阶级代表人物，是一批反革命的修正主义分子，一旦时机成熟，他们就会要夺取政权，由无产阶级专政变为资产阶级专政。这些人物，有些已被我们识破了，有些则还没有被识破，有些正在受到我们信用，被培养为我们的接班人，例如赫鲁晓夫那样的人物，他们现正睡在我们的身旁，各级党委必须充分注意这一点。
“卧榻之畔，岂容他人酣睡？”
“被培养为我们的接班人”的“赫鲁晓夫那样的人物”是指谁？
在刘少奇回国前，《中国共产党中央委员会通知》已经定稿，新的“中央文革小组”已经成立，由陈伯达任组长，康生任顾问，江青、张春桥等任副组长，成员有王力、关锋、戚本禹、姚文元，直接隶属于中央政治局常委领导。
4月24日，杭州会议基本上通过《中国共产党中央委员会通知》，并决定召开中央政治局扩大会议，讨论和正式通过这个文件，并对彭真、罗瑞卿、陆定一、杨尚昆四人作出组织处理。
1966年5月4日，刘少奇主持中央政治局扩大会议，在毛泽东的领导下，会议对彭真、罗瑞卿、陆定一、杨尚昆进行了错误批判。5月16日，会议正式通过了《中国共产党中央委员会通知》，即发动文化大革命的“五一六通知”。
整个通知稿，原封不动，一字未改，甚至一个标点符号都没有动，可以称得上“原汁原味”。
刘少奇对康生、陈伯达等人全盘否定其他人意见甚至连标点符号都不能改动的做法有不同的意见：
开政治局扩大会议叫大家讨论，结果提了意见不改，连几个字都不能改，这不是独断专行吗？这不是不符合民主集中制吗？我原来考虑过改一点，现在大家意见还是不改的好，不如原来的好，那就不改吧！
《通知》对彭真进行了点名批判。
刘少奇问彭真：“彭真同志，你有什么意见？”
彭真说：“一个检查，一个改。”
刘少奇问：“对通知有什么意见？”
彭真答：“没有意见。”
“是赞成，还是反对？”
彭真低头看材料，没有回答。
毛泽东对通知进行了修改，加写了几段话，其中讲：“混进党里、政府里、军队里和各种文化界的资产阶级代表人物，是一批反革命的修正主义分子，一旦时机成熟，他们就会要夺取政权，由无产阶级专政变为资产阶级专政。这些人物，有些已被我们识破了，有些则还没有被识破，有些正在受到我们信用，被培养为我们的接班人，例如赫鲁晓夫那样的人�